علی بختیاری
۱۳۹۱-۱۱-۰۱, 19:59
رنگ*آمیزی گرم
رنگ*آمیزی گرم (به انگلیسی (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D8%B2%D8%A8%D8%A7%D9%86_%D8%A7%D9%86%DA%AF%D9%84% DB%8C%D8%B3%DB%8C): Gram staining) یکی از مهم*ترین و متداولترین روش*های رنگ*آمیزی در میکروبیولوژی (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%85%DB%8C%DA%A9%D8%B1%D9%88%D8%A8%DB%8C%D9%88%D 9%84%D9%88%DA%98%DB%8C) است که اولین بار توسط کریستین گرم (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%DA%A9%D8%B1%DB%8C%D8%B3%D8%AA%DB% 8C%D9%86_%DA%AF%D8%B1%D9%85&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF) ابداع شد. دراین رنگ آمیزی باکتری*ها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت (http://fa.wikipedia.org/wiki/%DA%AF%D8%B1%D9%85_%D9%85%D8%AB%D8%A8%D8%AA) و گرم منفی (http://fa.wikipedia.org/wiki/%DA%AF%D8%B1%D9%85_%D9%85%D9%86%D9%81%DB%8C) تقسیم می*شوند. رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد.دررنگ آمیزی گرم باکتری*های گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری*های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می*شود.
گرچه هر دو گروه یعنی باکتری*های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می*باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری*های گرم مثبت یک لایه ضخیمی*است از پپتیدوگلیکان، ولی در باکتری*های گرم منفی ضخامت آن به حداقل می*رسد.
پیش از آغاز رنگ آمیزی نخست باید یک فروتی از محیط کشت خالص باکتری بر روی لام تهیّه کنیم، در ادامه مراحل رنگ آمیزی گرم به قرار زیر هستند:
*فروتی : بر روی یک لام تمیز یک قطره سرم فیزیولوژی ریخته و مقداری از کلنی را با آنس برداشته و در آن ب خوبی حل می کنیم و اجازه می دهیم تا خشک شود.و سپس بوسیله چند بار گذراندن از روی شعله آن را فیکس می کنیم.
روش رنگ*آمیزی گرم
نخست رنگ کریستال ویوله (با فرمول (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%81%D8%B1%D9%85%D9%88%D9%84_%D8%B4%DB%8C%D9%85% DB%8C%D8%A7%DB%8C%DB%8C) C25N3H30Cl)رابه مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه برروی فروتی باکتری روی لام می ریزیم، درنتیجه همه باکتری*ها به رنگ بنفش درخواهد درآمد.
پس از شستشوی فروتی با آب، رنگ کریستال ویوله را با افزودن لوگول(خنثی نمودن PH) به مدّت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه تثبیت می کنیم. لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس*هایی می*نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می*شود. پس ازاین مرحله، همه باکتریها کماکان به رنگ بنفش مشاهده می*شوند .
مرحله رنگ زدایی:
مهم*ترین مرحله رنگ آمیزی است. دراین مرحله پس از شستشوی لام با آب٬ لام به مدت ۱۵ تا۲۰ ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می*گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می*گیرد. درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه*های پپتیدوگلیکان (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%BE%D9%BE%D8%AA%DB%8C%D8%AF%D9%88%DA%AF%D9%84%D B%8C%DA%A9%D8%A7%D9%86) محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه*ها وغشا می*گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می*دهد. ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایهٔ پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی*شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .
در انتها سطح فروتی رابا سافرانین(با فرمول (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%81%D8%B1%D9%85%D9%88%D9%84_%D8%B4%DB%8C%D9%85% DB%8C%D8%A7%DB%8C%DB%8C)C20H19N4Cl) یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه می*پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار می*گیرد. دراین مرحله باکتری*های بی رنگ (باکتری*های گرم منفی) به رنگ قرمز یا صورتی درمی*آیند وباکتری*های بنفش یا آبی (باکتری*های گرم مثبت) بدون تغییر رنگ باقی می*مانند .
واژه CLAS برای رنگ آمیزی گرم به رمز این روش معروف میباشد
C رنگ کریستال ویوله
L لوگول
A استون الکل
S سافرانین
در رنگ آمیزی گرم مثبت باکتریها را به 5 گروه تقسیم بندی می کنند:
1- میله ای (باسیل ) گرم مثبت 2- میله ای گرم منفی 3- کوکوس (گرد) گرم مثبت 4- کوکوس گرم منفی 5- باکتریهای بدون واکنش به رنگ آمیزی گرم.
در این رنگ آمیزی می توان هر باکتری ناشناخته ای را در یکی از این 5 گروه قرار داده و با اطمینان 4 گروه دیگر را حذف کرد و به مطالعه در مورد آن باکتری پرداخت .
خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی :
1- باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.
2- گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود . پس هنگام
تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت . یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم متبت ، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در
لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.
3- باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .
4- باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری و
هضم و متلاشی شده آن می شوند.
طرز تهیه رنگها و محلولهای گرم :
1- کریستال ویوله :
- کریستال ویوله 2 گرم
- اتانول 95% 20سی سی
- اگزالات آمونیوم(خالص) 8/.گرم
- آب مقطر 80سی سی
کریستال ویوله را در اتانول حل کنید. اگزالات آمونیوم را در آب حل کنیدو سپس دو محلول را روی هم ریخته و بخوبی مخلوط کنید.
2- محلول ید (لوگل) :
- ید 1 گرم
- یدور پتاسیم 2 گرم
- آب مقطر 300 سی سی
ید و یدور پتاسیم را با هم در هاون بسائید تا کاملا نرم شود . مقدار کمی آب اضافه کنید تا محتویات هاون شسته شود. بقیه آب را هم اضافه کرده و
کاملا مخلوط کنید . این محلول را باید در شیشه تیره رنگ نگداری کنید.
3- محلول سافرانین :
- سافرانین 25 گرم
- اتانول 95% 10سی سی
- آب مقطر 100سی سی
سافرانین را در اتانول حل کنید . آب مقطر را اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را از کاغذ صافی عبور دهید.
4- محلول استن – الکل :
- اتانول 95% 70 سی سی
- استن 30سی سی
دو محلول را کاملا با هم مخلوط کنید.
از رنگ*آمیزی گرم به دو جهت استفاده می*شود:
1.شناسایی جنس باکتری
2.انتخاب آنتی*بیوتیک مناسب (باکتری*های گرم مثبت در مقایسه با باکتری*های گرم منفی نسبت به پنی*سیلین (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%BE%D9%86%DB%8C_%D8%B3%DB%8C%D9%84%DB%8C%D9%86) G حسّاسیت بیشتری دارند)
با این حال همهٔ باکتری*ها را نمی*توان با رنگ*آمیزی گرم مشاهده نمود. فهرستی از باکتری*های مهم از نظر پزشکی که با رنگ*آمیزی گرم قابل مشاهده نیستند در جدول زیر آمده است.
نام باکتری
علّت عدم مشاهده باکتری با روش گرم
روش رنگ آمیزی جایگزین
1
مایکوباکتریوم (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%85%D8%A7%DB%8C%DA%A9%D9%88%D8%A8%D8%A7%DA%A9%D 8%AA%D8%B1%DB%8C%D9%88%D9%85) ها شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%85%D8%A7%DB%8C%DA%A9%D9%88%D8%A8%D8%A7%DA%A9%D 8%AA%D8%B1%DB%8C%D9%88%D9%85_%D8%AA%D9%88%D8%A8%D8 %B1%DA%A9%D9%84%D9%88%D8%B2%DB%8C%D8%B3)
وجود مقدار زیادی چربی در دیواره سلولی که از نفوذ رنگ جلوگیری می*کند
رنگ*آمیزی اسید فاست (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D8%B1%D9%86%DA%AF%E2%80%8C%D8%A2%D9%85%DB%8C%D8%B 2%DB%8C_%D8%A7%D8%B3%DB%8C%D8%AF_%D9%81%D8%A7%D8%B 3%D8%AA)
2
ترپونما پالیدوم (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D8%AA%D8%B1%D9%BE%D9%88%D9%86%D9% 85%D8%A7_%D9%BE%D8%A7%D9%84%DB%8C%D8%AF%D9%88%D9%8 5&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF)
نازکتر از آن است که دیده شود
میکروسکوپ زمینه تاریک (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D9%85%DB%8C%DA%A9%D8%B1%D9%88%D8% B3%DA%A9%D9%88%D9%BE_%D8%B2%D9%85%DB%8C%D9%86%D9%8 7_%D8%AA%D8%A7%D8%B1%DB%8C%DA%A9&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF) یا آنتی بادی فلوئورسنت
3
مایکوپلاسما پنومونیه (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%85%D8%A7%DB%8C%DA%A9%D9%88%D9%BE%D9%84%D8%A7%D 8%B3%D9%85%D8%A7)
نبود دیواره سلولی (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D8%AF%DB%8C%D9%88%D8%A7%D8%B1%D9%87_%D8%B3%D9%84% D9%88%D9%84%DB%8C)
روشی وجود ندارد
4
لژیونلا پنومونیه (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D9%84%DA%98%DB%8C%D9%88%D9%86%D9% 84%D8%A7_%D9%BE%D9%86%D9%88%D9%85%D9%88%D9%86%DB%8 C%D9%87&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF)
عدم دریافت رنگ قرمز
طولانی نمودن مرحله افزودن سافرانین در رنگ آمیزی گرم
5
کلامیدیا (http://fa.wikipedia.org/wiki/%DA%A9%D9%84%D8%A7%D9%85%DB%8C%D8%AF%DB%8C%D8%A7) از جمله کلامیدیا تراکوماتیس
وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول
6
ریکتزیا (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D8%B1%DB%8C%DA%A9%D8%AA%D8%B2%DB% 8C%D8%A7&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF)
وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول
رنگ آمیزی گیمسا (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D8%B1%D9%86%DA%AF_%D8%A2%D9%85%DB %8C%D8%B2%DB%8C_%DA%AF%DB%8C%D9%85%D8%B3%D8%A7&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF) یا سایر رنگ آمیزی های بافتی
منبع : ویکیپدیا ،وبلاگ آزمایشات ، جزوات شخصی
رنگ*آمیزی گرم (به انگلیسی (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D8%B2%D8%A8%D8%A7%D9%86_%D8%A7%D9%86%DA%AF%D9%84% DB%8C%D8%B3%DB%8C): Gram staining) یکی از مهم*ترین و متداولترین روش*های رنگ*آمیزی در میکروبیولوژی (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%85%DB%8C%DA%A9%D8%B1%D9%88%D8%A8%DB%8C%D9%88%D 9%84%D9%88%DA%98%DB%8C) است که اولین بار توسط کریستین گرم (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%DA%A9%D8%B1%DB%8C%D8%B3%D8%AA%DB% 8C%D9%86_%DA%AF%D8%B1%D9%85&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF) ابداع شد. دراین رنگ آمیزی باکتری*ها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت (http://fa.wikipedia.org/wiki/%DA%AF%D8%B1%D9%85_%D9%85%D8%AB%D8%A8%D8%AA) و گرم منفی (http://fa.wikipedia.org/wiki/%DA%AF%D8%B1%D9%85_%D9%85%D9%86%D9%81%DB%8C) تقسیم می*شوند. رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتی به ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد.دررنگ آمیزی گرم باکتری*های گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری*های گرم منفی به رنگ قرمز مشاهده می*شود.
گرچه هر دو گروه یعنی باکتری*های گرم مثبت و منفی دارای دیواره می*باشند ولی فرق بین این دو گروه مربوط به خواصی است که در ساختمان دیواره سلولی آنها وجود دارد. اساس ساختمان در دیواره سلولی باکتری*های گرم مثبت یک لایه ضخیمی*است از پپتیدوگلیکان، ولی در باکتری*های گرم منفی ضخامت آن به حداقل می*رسد.
پیش از آغاز رنگ آمیزی نخست باید یک فروتی از محیط کشت خالص باکتری بر روی لام تهیّه کنیم، در ادامه مراحل رنگ آمیزی گرم به قرار زیر هستند:
*فروتی : بر روی یک لام تمیز یک قطره سرم فیزیولوژی ریخته و مقداری از کلنی را با آنس برداشته و در آن ب خوبی حل می کنیم و اجازه می دهیم تا خشک شود.و سپس بوسیله چند بار گذراندن از روی شعله آن را فیکس می کنیم.
روش رنگ*آمیزی گرم
نخست رنگ کریستال ویوله (با فرمول (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%81%D8%B1%D9%85%D9%88%D9%84_%D8%B4%DB%8C%D9%85% DB%8C%D8%A7%DB%8C%DB%8C) C25N3H30Cl)رابه مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه برروی فروتی باکتری روی لام می ریزیم، درنتیجه همه باکتری*ها به رنگ بنفش درخواهد درآمد.
پس از شستشوی فروتی با آب، رنگ کریستال ویوله را با افزودن لوگول(خنثی نمودن PH) به مدّت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه تثبیت می کنیم. لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس*هایی می*نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می*شود. پس ازاین مرحله، همه باکتریها کماکان به رنگ بنفش مشاهده می*شوند .
مرحله رنگ زدایی:
مهم*ترین مرحله رنگ آمیزی است. دراین مرحله پس از شستشوی لام با آب٬ لام به مدت ۱۵ تا۲۰ ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می*گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می*گیرد. درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه*های پپتیدوگلیکان (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%BE%D9%BE%D8%AA%DB%8C%D8%AF%D9%88%DA%AF%D9%84%D B%8C%DA%A9%D8%A7%D9%86) محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه*ها وغشا می*گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می*دهد. ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت ضخامت زیاد لایهٔ پپتیدوگلیکانی وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی*شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .
در انتها سطح فروتی رابا سافرانین(با فرمول (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%81%D8%B1%D9%85%D9%88%D9%84_%D8%B4%DB%8C%D9%85% DB%8C%D8%A7%DB%8C%DB%8C)C20H19N4Cl) یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت ۳۰ تا ۴۵ ثانیه می*پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار می*گیرد. دراین مرحله باکتری*های بی رنگ (باکتری*های گرم منفی) به رنگ قرمز یا صورتی درمی*آیند وباکتری*های بنفش یا آبی (باکتری*های گرم مثبت) بدون تغییر رنگ باقی می*مانند .
واژه CLAS برای رنگ آمیزی گرم به رمز این روش معروف میباشد
C رنگ کریستال ویوله
L لوگول
A استون الکل
S سافرانین
در رنگ آمیزی گرم مثبت باکتریها را به 5 گروه تقسیم بندی می کنند:
1- میله ای (باسیل ) گرم مثبت 2- میله ای گرم منفی 3- کوکوس (گرد) گرم مثبت 4- کوکوس گرم منفی 5- باکتریهای بدون واکنش به رنگ آمیزی گرم.
در این رنگ آمیزی می توان هر باکتری ناشناخته ای را در یکی از این 5 گروه قرار داده و با اطمینان 4 گروه دیگر را حذف کرد و به مطالعه در مورد آن باکتری پرداخت .
خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی :
1- باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.
2- گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود . پس هنگام
تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت . یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم متبت ، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در
لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.
3- باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .
4- باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری و
هضم و متلاشی شده آن می شوند.
طرز تهیه رنگها و محلولهای گرم :
1- کریستال ویوله :
- کریستال ویوله 2 گرم
- اتانول 95% 20سی سی
- اگزالات آمونیوم(خالص) 8/.گرم
- آب مقطر 80سی سی
کریستال ویوله را در اتانول حل کنید. اگزالات آمونیوم را در آب حل کنیدو سپس دو محلول را روی هم ریخته و بخوبی مخلوط کنید.
2- محلول ید (لوگل) :
- ید 1 گرم
- یدور پتاسیم 2 گرم
- آب مقطر 300 سی سی
ید و یدور پتاسیم را با هم در هاون بسائید تا کاملا نرم شود . مقدار کمی آب اضافه کنید تا محتویات هاون شسته شود. بقیه آب را هم اضافه کرده و
کاملا مخلوط کنید . این محلول را باید در شیشه تیره رنگ نگداری کنید.
3- محلول سافرانین :
- سافرانین 25 گرم
- اتانول 95% 10سی سی
- آب مقطر 100سی سی
سافرانین را در اتانول حل کنید . آب مقطر را اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را از کاغذ صافی عبور دهید.
4- محلول استن – الکل :
- اتانول 95% 70 سی سی
- استن 30سی سی
دو محلول را کاملا با هم مخلوط کنید.
از رنگ*آمیزی گرم به دو جهت استفاده می*شود:
1.شناسایی جنس باکتری
2.انتخاب آنتی*بیوتیک مناسب (باکتری*های گرم مثبت در مقایسه با باکتری*های گرم منفی نسبت به پنی*سیلین (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%BE%D9%86%DB%8C_%D8%B3%DB%8C%D9%84%DB%8C%D9%86) G حسّاسیت بیشتری دارند)
با این حال همهٔ باکتری*ها را نمی*توان با رنگ*آمیزی گرم مشاهده نمود. فهرستی از باکتری*های مهم از نظر پزشکی که با رنگ*آمیزی گرم قابل مشاهده نیستند در جدول زیر آمده است.
نام باکتری
علّت عدم مشاهده باکتری با روش گرم
روش رنگ آمیزی جایگزین
1
مایکوباکتریوم (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%85%D8%A7%DB%8C%DA%A9%D9%88%D8%A8%D8%A7%DA%A9%D 8%AA%D8%B1%DB%8C%D9%88%D9%85) ها شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%85%D8%A7%DB%8C%DA%A9%D9%88%D8%A8%D8%A7%DA%A9%D 8%AA%D8%B1%DB%8C%D9%88%D9%85_%D8%AA%D9%88%D8%A8%D8 %B1%DA%A9%D9%84%D9%88%D8%B2%DB%8C%D8%B3)
وجود مقدار زیادی چربی در دیواره سلولی که از نفوذ رنگ جلوگیری می*کند
رنگ*آمیزی اسید فاست (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D8%B1%D9%86%DA%AF%E2%80%8C%D8%A2%D9%85%DB%8C%D8%B 2%DB%8C_%D8%A7%D8%B3%DB%8C%D8%AF_%D9%81%D8%A7%D8%B 3%D8%AA)
2
ترپونما پالیدوم (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D8%AA%D8%B1%D9%BE%D9%88%D9%86%D9% 85%D8%A7_%D9%BE%D8%A7%D9%84%DB%8C%D8%AF%D9%88%D9%8 5&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF)
نازکتر از آن است که دیده شود
میکروسکوپ زمینه تاریک (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D9%85%DB%8C%DA%A9%D8%B1%D9%88%D8% B3%DA%A9%D9%88%D9%BE_%D8%B2%D9%85%DB%8C%D9%86%D9%8 7_%D8%AA%D8%A7%D8%B1%DB%8C%DA%A9&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF) یا آنتی بادی فلوئورسنت
3
مایکوپلاسما پنومونیه (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%85%D8%A7%DB%8C%DA%A9%D9%88%D9%BE%D9%84%D8%A7%D 8%B3%D9%85%D8%A7)
نبود دیواره سلولی (http://fa.wikipedia.org/wiki/%D8%AF%DB%8C%D9%88%D8%A7%D8%B1%D9%87_%D8%B3%D9%84% D9%88%D9%84%DB%8C)
روشی وجود ندارد
4
لژیونلا پنومونیه (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D9%84%DA%98%DB%8C%D9%88%D9%86%D9% 84%D8%A7_%D9%BE%D9%86%D9%88%D9%85%D9%88%D9%86%DB%8 C%D9%87&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF)
عدم دریافت رنگ قرمز
طولانی نمودن مرحله افزودن سافرانین در رنگ آمیزی گرم
5
کلامیدیا (http://fa.wikipedia.org/wiki/%DA%A9%D9%84%D8%A7%D9%85%DB%8C%D8%AF%DB%8C%D8%A7) از جمله کلامیدیا تراکوماتیس
وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول
6
ریکتزیا (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D8%B1%DB%8C%DA%A9%D8%AA%D8%B2%DB% 8C%D8%A7&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF)
وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول
رنگ آمیزی گیمسا (http://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=%D8%B1%D9%86%DA%AF_%D8%A2%D9%85%DB %8C%D8%B2%DB%8C_%DA%AF%DB%8C%D9%85%D8%B3%D8%A7&action=edit&redlink=1&preload=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8%A C%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D9%88%D8%A7%D9%86%E2%80%8 C%D8%A8%D9%86%D8%AF%DB%8C&editintro=%D8%A7%D9%84%DA%AF%D9%88:%D8%A7%DB%8C%D8 %AC%D8%A7%D8%AF+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87/%D8%A7%D8%AF%DB%8C%D8%AA%E2%80%8C%D9%86%D9%88%D8%A A%DB%8C%D8%B3&summary=%D8%A7%DB%8C%D8%AC%D8%A7%D8%AF+%DB%8C%DA%A 9+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D9%86%D9%88+%D8% A7%D8%B2+%D8%B7%D8%B1%DB%8C%D9%82+%D8%A7%DB%8C%D8% AC%D8%A7%D8%AF%DA%AF%D8%B1&nosummary=&prefix=&minor=&create=%D8%AF%D8%B1%D8%B3%D8%AA+%DA%A9%D8%B1%D8%AF %D9%86+%D9%85%D9%82%D8%A7%D9%84%D9%87+%D8%AC%D8%AF %DB%8C%D8%AF) یا سایر رنگ آمیزی های بافتی
منبع : ویکیپدیا ،وبلاگ آزمایشات ، جزوات شخصی